猪乙型脑炎（HW1株）细胞灭活疫苗免疫抗体水平
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时间：2017-12-31
日本脑炎病毒（Japanese encephalitis vrus， JEV）是一种危害严重的人兽共患传染病原，可引起人类脑炎，平均死亡率高达20%，而幸存者中约有57%～68%留有不同程度的后遗症[1]。全球每年感染JEV人数超过1 000万人，亚洲每年乙型脑炎（JE）病例有5万多人，而我国是JE发病最多的国家，占全世界当年总发病人数的80%以上，因此JE是我国公共卫生的重要问题之一[1]。据调查我国猪群JE阳性率为18.12%～46.68%，不同地域流行存在差异[2]。JEV对猪的致死率不高，主要引起繁殖障碍性疫病，但猪是JEV的主要增殖宿主和传染源。我国猪的饲养数量大、更新快，JEV容易通过猪-蚊-猪的循环扩大病毒的传播，预防和控制猪的感染和灭蚊是防止人患JE的重要措施。我国猪用乙型脑炎疫苗现有SA14-14-2株减毒活疫苗和HW1株鼠脑灭活疫苗。猪感染JEV后会出现较高的毒血症，虽然已有报道SA14-14-2株稳定性较好，但主要毒力蛋白上依然有回复突变可能[3]，且SA14-14-2可在三带喙库蚊体内繁殖[4]，该毒株对乙型脑炎的流行与传播的影响尚不清楚。而鼠脑灭活疫苗抗原成分较为复杂，副反应较大。因此，研究更为安全、稳定的JE疫苗是防治该病的主要方向。本研究选择免疫保护性较好的乙型脑炎HW1株，用细胞悬浮培养来代替鼠脑增殖，制备了一批灭活疫苗，并对比了商品化的乙型脑炎鼠脑疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）以及自制乙型脑炎细胞灭活苗（HW1株）的免疫效果。
1 材料与方法
1.1 材料
乙型脑炎病毒HW1株、BHK21均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存；20只15 kg左右的仔猪购自武汉某猪场。
1.2 主要试剂
DMEM培养基、新生牛血清、青、链霉素购自GIBCO公司；水包油相佐剂SDA-25购自赛德奥生物科技（北京）有限公司；猪乙型脑炎油乳剂灭活疫苗购自武汉中博生物股份有限公司；猪乙型脑炎减毒活疫苗、猪乙型脑炎抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 病毒增殖 采用细胞悬浮技术培养BHK21细胞至其密度为3×107个/mL。用DMEM培养基稀释病毒至TCID50=107/mL，将病毒液与细胞悬液按1∶10的体积混合，经48 h悬浮培养后收获培养液，反复冻融2次后，离心取上清，置于-20 ℃保存备用。
1.3.2 病毒TCID50的测定 准备长满单层BHK-21细胞的96孔板，将待检病JEV毒液用DMEM培养基做10倍梯度稀释至10-5～10-10，每个稀释度接种8个孔，每孔100 μL，并设立阴性对照孔。观察记录细胞病变情况，计算各稀释度病变细胞孔的百分率。按Reed-Muench法计算待测病毒的TCID50。
1.3.3 乙型脑炎灭活疫苗的制备 将制苗用病毒液按体积加入0.2%甲醛溶液，37 ℃灭活48 h。将灭菌处理的SDA-25佐剂与病毒液按体积比1∶3乳化30 min，乳化结束前加入1%硫柳汞，定量分装，加盖密封，2～8 ℃保存备用。
1.3.4 仔猪免疫试验 将20只JEV抗体为阴性仔猪随机分为4组，每组5只。分别接种乙型脑炎鼠脑疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）、自制乙型脑炎细胞灭活疫苗（HW1株）以及PBS。商品化疫苗按疫苗说明书进行免疫，自制疫苗每只肌注2 mL，首免14 d后同等剂量加强免疫一次。所有仔猪于首免后的1、2、3、4、5、6、7、8周无菌采血，分离血清，保存于-20 ℃备用。
1.3.5 免疫抗体水平检测 使用乙脑抗体检测试剂盒检测血清抗体，并使用SPSS软件对数据进行分析。不同免疫组阳性峰值血清进行血清中和效价的检测，具体方法为：将JEV病毒稀释为200 TCID50，待检血清补体灭活后倍比稀释至2-2～2-8，将病毒与不同稀释度的待检血清等量混合，置于37 ℃作用60 min。每個稀释度接种6个孔，观察并记录出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算半数保护量（PD50），然后计算待检血清的中和效价。
2 结果与分析
2.1 病毒毒价测定
在BHK21悬浮细胞上进行HW1株的增殖，连续传5次，其TCID50分别为106.9/mL、107.1/mL、107.5/mL、107.4/mL和107.3/mL，毒价稳定，可用于配制疫苗。
2.2 仔猪血清乙型脑炎抗体检测及抗体消长情况
乙型脑炎弱毒疫苗免疫组在免疫1周以后抗体转阳，鼠脑灭活疫苗和细胞灭活疫苗免疫组均在免疫后第2周抗体转阳。鼠脑灭活疫苗在随后的抗体监测结果与未免疫组差异不显著。弱毒疫苗组和细胞灭活疫苗组分别在第2周和第3周出现抗体峰值，随后逐周下降，但直至第8周抗体水平仍然呈阳性（图1）。
1 材料与方法
1.1 材料
乙型脑炎病毒HW1株、BHK21均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存；20只15 kg左右的仔猪购自武汉某猪场。
1.2 主要试剂
DMEM培养基、新生牛血清、青、链霉素购自GIBCO公司；水包油相佐剂SDA-25购自赛德奥生物科技（北京）有限公司；猪乙型脑炎油乳剂灭活疫苗购自武汉中博生物股份有限公司；猪乙型脑炎减毒活疫苗、猪乙型脑炎抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 病毒增殖 采用细胞悬浮技术培养BHK21细胞至其密度为3×107个/mL。用DMEM培养基稀释病毒至TCID50=107/mL，将病毒液与细胞悬液按1∶10的体积混合，经48 h悬浮培养后收获培养液，反复冻融2次后，离心取上清，置于-20 ℃保存备用。
1.3.2 病毒TCID50的测定 准备长满单层BHK-21细胞的96孔板，将待检病JEV毒液用DMEM培养基做10倍梯度稀释至10-5～10-10，每个稀释度接种8个孔，每孔100 μL，并设立阴性对照孔。观察记录细胞病变情况，计算各稀释度病变细胞孔的百分率。按Reed-Muench法计算待测病毒的TCID50。
1.3.3 乙型脑炎灭活疫苗的制备 将制苗用病毒液按体积加入0.2%甲醛溶液，37 ℃灭活48 h。将灭菌处理的SDA-25佐剂与病毒液按体积比1∶3乳化30 min，乳化结束前加入1%硫柳汞，定量分装，加盖密封，2～8 ℃保存备用。
1.3.4 仔猪免疫试验 将20只JEV抗体为阴性仔猪随机分为4组，每组5只。分别接种乙型脑炎鼠脑疫苗、弱毒疫苗（SA14-14-2株）、自制乙型脑炎细胞灭活疫苗（HW1株）以及PBS。商品化疫苗按疫苗说明书进行免疫，自制疫苗每只肌注2 mL，首免14 d后同等剂量加强免疫一次。所有仔猪于首免后的1、2、3、4、5、6、7、8周无菌采血，分离血清，保存于-20 ℃备用。
1.3.5 免疫抗体水平检测 使用乙脑抗体检测试剂盒检测血清抗体，并使用SPSS软件对数据进行分析。不同免疫组阳性峰值血清进行血清中和效价的检测，具体方法为：将JEV病毒稀释为200 TCID50，待检血清补体灭活后倍比稀释至2-2～2-8，将病毒与不同稀释度的待检血清等量混合，置于37 ℃作用60 min。每個稀释度接种6个孔，观察并记录出现CPE的孔数，按Reed-Muench法计算半数保护量（PD50），然后计算待检血清的中和效价。
2 结果与分析
2.1 病毒毒价测定
在BHK21悬浮细胞上进行HW1株的增殖，连续传5次，其TCID50分别为106.9/mL、107.1/mL、107.5/mL、107.4/mL和107.3/mL，毒价稳定，可用于配制疫苗。
2.2 仔猪血清乙型脑炎抗体检测及抗体消长情况
乙型脑炎弱毒疫苗免疫组在免疫1周以后抗体转阳，鼠脑灭活疫苗和细胞灭活疫苗免疫组均在免疫后第2周抗体转阳。鼠脑灭活疫苗在随后的抗体监测结果与未免疫组差异不显著。弱毒疫苗组和细胞灭活疫苗组分别在第2周和第3周出现抗体峰值，随后逐周下降，但直至第8周抗体水平仍然呈阳性（图1）。
2.3 血清中和试验
血清中和试验结果（图2）显示，鼠脑灭活疫苗组、弱毒疫苗组和细胞灭活疫苗组的平均中和效价分别为1∶4、1∶22和1∶107。细胞灭活疫苗组高于阴性对照组、鼠脑灭活疫苗组和弱毒疫苗组，且差异均极显著（P<0.01）。
3 小结与讨论
目前我國猪乙型脑炎病主要采用弱毒活疫苗（SA14-14-2株）来进行预防控制，围绕该毒株也进行了不少类型疫苗的研制与探索[5，6]，但该疫苗毒株源于人用疫苗毒株，且能在中间宿主蚊子体内增殖，虽然尚无该毒株反强的报道，但广泛地应用在猪乙型脑炎病的防控中是存在一定风险的。
本研究对比了乙型脑炎鼠脑灭活疫苗（HW1株）、弱毒疫苗（SA14-14-2株）和自制细胞灭活疫苗（HW1株）对仔猪的免疫效果。从IgG抗体水平检测以及血清中和试验的结果来看，自制细胞灭活疫苗的免疫效果要优于鼠脑灭活疫苗（HW1株）和弱毒疫苗（SA14-14-2株），且免疫保护期与弱毒疫苗相当。考虑到弱毒疫苗除激活体液免疫产生中和抗体外，还能引起机体的细胞免疫，下一步将开展动物攻毒保护试验，进一步评价猪乙型脑炎（HW1株）细胞灭活疫苗免疫效果。
参考文献：
[1] RUPINFERJEET K，MANISH R，SUDHANSHU V. Immunogenicity in mice of cationic microparticle-adsorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Vaccine， 2004，22（8）：2776-2782.
[2] 范 煜，曹瑞兵，陈溥言.2014年我国不同生态地区猪乙型脑炎野毒感染的流行病学调查[A].中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C].广州：中国畜牧兽医学会，2014.
[3] 许乐燕，徐闻青，徐帆洪，等.乙型脑炎病毒SA-（14）-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性[J].中国生物制品学杂志，2008（10）：833-837.
[4] 冯 云，张海林，俞永新，等.三带喙库蚊胸腔接种乙型脑炎减毒活疫苗病毒的感染动态及致病力观察[J].中国人兽共患病学报， 2007（3）：278-281.
[5] 李自力，陈焕春，徐高原，等.表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建[J].畜牧兽医学报，2007，38（1）：53-58.
[6] 王晓杜，赵凡凡，代 兵，等.猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析[J].畜牧兽医学报，2015，46（1）：111-118.
血清中和试验结果（图2）显示，鼠脑灭活疫苗组、弱毒疫苗组和细胞灭活疫苗组的平均中和效价分别为1∶4、1∶22和1∶107。细胞灭活疫苗组高于阴性对照组、鼠脑灭活疫苗组和弱毒疫苗组，且差异均极显著（P<0.01）。
3 小结与讨论
目前我國猪乙型脑炎病主要采用弱毒活疫苗（SA14-14-2株）来进行预防控制，围绕该毒株也进行了不少类型疫苗的研制与探索[5，6]，但该疫苗毒株源于人用疫苗毒株，且能在中间宿主蚊子体内增殖，虽然尚无该毒株反强的报道，但广泛地应用在猪乙型脑炎病的防控中是存在一定风险的。
本研究对比了乙型脑炎鼠脑灭活疫苗（HW1株）、弱毒疫苗（SA14-14-2株）和自制细胞灭活疫苗（HW1株）对仔猪的免疫效果。从IgG抗体水平检测以及血清中和试验的结果来看，自制细胞灭活疫苗的免疫效果要优于鼠脑灭活疫苗（HW1株）和弱毒疫苗（SA14-14-2株），且免疫保护期与弱毒疫苗相当。考虑到弱毒疫苗除激活体液免疫产生中和抗体外，还能引起机体的细胞免疫，下一步将开展动物攻毒保护试验，进一步评价猪乙型脑炎（HW1株）细胞灭活疫苗免疫效果。
参考文献：
[1] RUPINFERJEET K，MANISH R，SUDHANSHU V. Immunogenicity in mice of cationic microparticle-adsorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Vaccine， 2004，22（8）：2776-2782.
[2] 范 煜，曹瑞兵，陈溥言.2014年我国不同生态地区猪乙型脑炎野毒感染的流行病学调查[A].中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C].广州：中国畜牧兽医学会，2014.
[3] 许乐燕，徐闻青，徐帆洪，等.乙型脑炎病毒SA-（14）-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性[J].中国生物制品学杂志，2008（10）：833-837.
[4] 冯 云，张海林，俞永新，等.三带喙库蚊胸腔接种乙型脑炎减毒活疫苗病毒的感染动态及致病力观察[J].中国人兽共患病学报， 2007（3）：278-281.
[5] 李自力，陈焕春，徐高原，等.表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建[J].畜牧兽医学报，2007，38（1）：53-58.
[6] 王晓杜，赵凡凡，代 兵，等.猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析[J].畜牧兽医学报，2015，46（1）：111-118.
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