畜禽养殖环境金黄色葡萄球菌耐药性及毒力因子
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时间：2017-12-31
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，可以在动物和人类之间交叉感染，是医学和兽医临床上最常见的病原[1]。作为革兰阳性菌的代表，它可引起人和动物的皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎、脑膜炎、骨髓炎和中毒性休克综合征等疾病[2]。兽医临床上常因养殖场饲养密度过大、通风不良、卫生条件差、动物皮肤由于护栏等划破而感染金黄色葡萄球菌，该病易传染，不易治愈，给畜禽养殖造成极大的经济损失。目前，在动物养殖过程中主要通过抗生素来治疗。由于金黄色葡萄球菌对抗生素极易产生耐药性，且其耐药周期越来越短，因此金黄色葡萄球菌病已成为临床治疗的难题。近年来，由畜禽粪便污染引起的人畜共患病的传播与感染现象已引起人们对畜禽粪便病原微生物污染的重視。有报道称，畜禽粪便废弃物中有多种潜在的致病微生物，如果畜禽粪便不进行无害化处理，直接排放到环境中，这些致病菌将污染环境。此外由于畜禽养殖过程中大量使用抗生素，使得动物体内的细菌耐药菌株数量增加，而耐药菌株随着畜禽粪便和污水排放甚至作为农用有机肥料施用，带有耐药基因的菌株进入环境，其抗药性基因可能通过接合、转化等重组方式转移到新的病原菌，这些耐药菌可能通过“土壤-植物-动物-人”食物链的途径进入人体，将严重威胁人类健康。本研究对畜禽养殖环境中金黄色葡萄球菌进行分离，并对其耐药性、毒力因子进行分析，以期为畜禽养殖粪便无害化处理及排放提供参考。
1 材料与方法
1.1 样品采集
分别于2013年7月至2015年5月对江苏省南京、南通、盐城和云南省嵩明县、曲靖市等8家不同类型的畜禽养殖场排放物及周围环境进行采样，共采集样品24个（其中排放物样品、土壤样品和水样各8个）。
畜禽排放物样品：采集养殖场粪便临时堆积场的粪便，采集粪堆表层（1～20 cm）和中层（20～40 cm）各3个样混合。
土壤样品：采集养殖场附近施用过畜禽粪肥的农田，随机选择3个点，采集表层土壤（5～10 cm），混合。
水样：采集离养殖场污水排放口1 km左右的水体，采集距水面10～15 cm深处水样， 每个样品采集1 000 mL。
1.2 金黄色葡萄球菌的分离及鉴定
准确称取10 g土壤/粪便样本加入到100 mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10 min，使土壤与水充分混合，制备出10-1土壤/粪便悬液。用无菌吸管吸取1 mL土壤/粪便悬液，倍比稀释到10-2、10-3稀释度，用移液器分别从10-2、10-3稀释度试管中各吸取0.1 mL涂布至Baird-Parker培养基上；水样取100 mL进行过滤，将滤膜直接贴在Baird-Parker培养基，经37 ℃培养48 h培养，挑取可疑菌落用VITEK2 Compact全自动微生物生化鉴定仪作生化鉴定及凝固酶试验。
1.3 药敏试验
采用美国临床实验室标准委员会推荐的Kirby-Bauer琼脂扩散法[3]，选择医疗和畜禽养殖最常用的10种抗生素进行药物敏感性试验。抗生素纸片（杭州微生物试剂有限公司）种类及其抗生素含量为：复方新诺明（23.75、1.25 μg/片），环丙沙星（5 μg/片），诺氟沙星（10 μg/片），青霉素（15 U/片），氨苄西林（10 μg/片），头孢唑啉（30 μg/片），丁胺卡那（30 μg/片），庆大霉素（10 μg/片），氟苯尼考（30 μg/片），罗红霉素（15 μg/片），OXOID公司，从琼脂斜面分别挑取各试验菌株1～2铂耳圈接种于营养肉汤中，37 ℃培养18～20 h，用生理盐水进行适当稀释至菌含量在105个/mL，吸取0.1 mL加到MH平板上，涂布均匀，贴上药敏纸片，37 ℃培养18～20 h，测量抑菌圈直径，按照CLSI标准判断耐药性。
1.4 毒力因子检测
溶血素的检测：将分离获得的菌株纯培养物接种在含5%绵阳鲜血LB琼脂平板上，37 ℃培养18～20 h，观察溶血状况。
胞外蛋白酶的检测：将分离获得的菌株纯培养物点种在含1%脱脂奶粉LB琼脂平板上，37 ℃培养18～20 h，观察是否形成透明圈。
1.5 生物膜检测
将获得的菌株接种到装有2 mL LB培养基的试管中，37 ℃培养48 h后，将试管中的培养液倒净，加入3 mL的1%结晶紫溶液，室温下孵育5 min，将结晶紫溶液倒净，用PBS冲洗试管3～5 min，将试管倒置在滤纸上去除试管中多余的水分，把试管放在37 ℃烘箱中烘干，观察记录[3]。
2 结果与分析
2.1 金黄色葡萄球菌分离鉴定
从不同类型的畜禽养殖场粪便、施用过畜禽粪便作为肥料的土壤以及水体样品中共分离出金黄色葡萄球菌20株，在LB平板上形成典型的湿润且呈黄色的菌落。
2.2 金黄色葡萄球菌耐药性检测结果
1 材料与方法
1.1 样品采集
分别于2013年7月至2015年5月对江苏省南京、南通、盐城和云南省嵩明县、曲靖市等8家不同类型的畜禽养殖场排放物及周围环境进行采样，共采集样品24个（其中排放物样品、土壤样品和水样各8个）。
畜禽排放物样品：采集养殖场粪便临时堆积场的粪便，采集粪堆表层（1～20 cm）和中层（20～40 cm）各3个样混合。
土壤样品：采集养殖场附近施用过畜禽粪肥的农田，随机选择3个点，采集表层土壤（5～10 cm），混合。
水样：采集离养殖场污水排放口1 km左右的水体，采集距水面10～15 cm深处水样， 每个样品采集1 000 mL。
1.2 金黄色葡萄球菌的分离及鉴定
准确称取10 g土壤/粪便样本加入到100 mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10 min，使土壤与水充分混合，制备出10-1土壤/粪便悬液。用无菌吸管吸取1 mL土壤/粪便悬液，倍比稀释到10-2、10-3稀释度，用移液器分别从10-2、10-3稀释度试管中各吸取0.1 mL涂布至Baird-Parker培养基上；水样取100 mL进行过滤，将滤膜直接贴在Baird-Parker培养基，经37 ℃培养48 h培养，挑取可疑菌落用VITEK2 Compact全自动微生物生化鉴定仪作生化鉴定及凝固酶试验。
1.3 药敏试验
采用美国临床实验室标准委员会推荐的Kirby-Bauer琼脂扩散法[3]，选择医疗和畜禽养殖最常用的10种抗生素进行药物敏感性试验。抗生素纸片（杭州微生物试剂有限公司）种类及其抗生素含量为：复方新诺明（23.75、1.25 μg/片），环丙沙星（5 μg/片），诺氟沙星（10 μg/片），青霉素（15 U/片），氨苄西林（10 μg/片），头孢唑啉（30 μg/片），丁胺卡那（30 μg/片），庆大霉素（10 μg/片），氟苯尼考（30 μg/片），罗红霉素（15 μg/片），OXOID公司，从琼脂斜面分别挑取各试验菌株1～2铂耳圈接种于营养肉汤中，37 ℃培养18～20 h，用生理盐水进行适当稀释至菌含量在105个/mL，吸取0.1 mL加到MH平板上，涂布均匀，贴上药敏纸片，37 ℃培养18～20 h，测量抑菌圈直径，按照CLSI标准判断耐药性。
1.4 毒力因子检测
溶血素的检测：将分离获得的菌株纯培养物接种在含5%绵阳鲜血LB琼脂平板上，37 ℃培养18～20 h，观察溶血状况。
胞外蛋白酶的检测：将分离获得的菌株纯培养物点种在含1%脱脂奶粉LB琼脂平板上，37 ℃培养18～20 h，观察是否形成透明圈。
1.5 生物膜检测
将获得的菌株接种到装有2 mL LB培养基的试管中，37 ℃培养48 h后，将试管中的培养液倒净，加入3 mL的1%结晶紫溶液，室温下孵育5 min，将结晶紫溶液倒净，用PBS冲洗试管3～5 min，将试管倒置在滤纸上去除试管中多余的水分，把试管放在37 ℃烘箱中烘干，观察记录[3]。
2 结果与分析
2.1 金黄色葡萄球菌分离鉴定
从不同类型的畜禽养殖场粪便、施用过畜禽粪便作为肥料的土壤以及水体样品中共分离出金黄色葡萄球菌20株，在LB平板上形成典型的湿润且呈黄色的菌落。
2.2 金黄色葡萄球菌耐药性检测结果
分离得到的20株金黄色葡萄球菌对10种常用抗菌药物具有不同程度的耐药性，对青霉素、氨苄西林、复方新诺明耐药性较高，对氟苯尼考、头孢唑啉、丁胺卡那敏感性较高（表1）。
2.3 毒力因子的检测结果
在5%绵羊血平板上，20株金黄色葡萄球菌环境分离菌株生长良好，菌落较大，呈圆形、光滑凸起的金黄色菌落，有15株分离菌株的菌落周围生成完全溶血的透明圈（图1）。在脱脂奶粉平板上有18株菌株能形成溶蛋白圈（图2），说明这些菌株都能够产生溶血素和胞外蛋白酶。
2.4 生物膜检测结果
在没有外界因素诱导的条件下，20株环境分离菌株中共有17株在试管上能形成肉眼可见的生物膜， 有的在试管上形成很厚的生物膜，经结晶紫染色后试管液面部分和底部都留有结晶紫，生物膜形成能力弱的菌株仅在底部可以看到有结晶紫存在，而不能形成生物膜的菌株试管壁上几乎没有结晶紫存在（图3）。
3 讨论
随着畜禽养殖集约化的发展，抗生素作为禽畜疾病预防及药物治疗、促生长饲料添加剂等被广泛应用，而抗生素的滥用，导致耐药菌不断出现。畜禽养殖场废弃物如果不经过无害化处理直接排放到自然界，其中的抗生素将可能对土壤和水体造成严重的污染，表现为破坏土壤和水体中的菌群结构、打破微生态平衡并诱导耐药菌产生，威胁人类健康安全。近年来， 由畜禽粪便污染引起的人畜共患病传播与感染，已引起人们对畜禽粪便病原微生物污染的重视。
金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布，是人畜皮肤、呼吸道、消化道黏膜上的常见菌群。当机体黏膜和皮肤破损或者抵抗力降低时，可通过损伤的皮肤、黏膜、呼吸道及消化道感染导致发病。金黄色葡萄球菌是畜禽养殖过程中最为常见的一種化脓性病原菌之一，能够引起畜禽多种疾病。以断奶后的仔猪易多发葡萄球菌病，主要表现为渗出性皮炎。牛常表现为坏疽性乳房炎和传染性乳房炎。禽在临床上表现症状很多，幼雏和中雏多呈败血症、浮肿性皮炎，成年鸡则多表现为关节炎、关节滑囊炎、腱鞘炎、脚球瘤等，还可见到化脓性骨髓炎、脓性眼炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌的致病性跟其能否产生毒力因子有关，这些毒力因子能协助金黄色葡萄球菌侵袭组织细胞、逃避机体免疫系统的清除、产生耐药性等，其主要的毒力因子是胞外毒素和酶以及产生生物膜[4]。金黄色葡萄球菌侵入与产生的胞外蛋白酶有关，而进入机体后产生另外一些毒力因子进一步破坏宿主的组织器官，特别是α溶血素， 能够引起组织损伤，破坏宿主的免疫系统[5]，本研究发现，从养殖场粪便及周边环境中分离的菌株大部分能产生蛋白酶和溶血素，说明这些菌株具有一定的致病性。对分离菌株进行生物膜形成能力的测定发现，这些菌株在一定程度上能形成生物膜。生物膜一旦形成便可保护细菌不受传统抗菌药物的作用，导致长期的抗生素治疗无效。生物膜还可以保护细菌逃离体内的免疫反应，在恶劣的环境中持续存活下来[6]。
本研究通过对江苏和云南不同养殖场环境中金黄色葡萄球菌的调查，从养殖场的粪便以及周边的土壤和水体中都能够分离到金黄色葡萄球菌，通过对分离菌株进行药物敏感试验，结果显示，大部分环境分离菌株对10种养殖场常用药物都具有一定程度的耐药。孙燕萍[7]对来源于畜禽生肉和养殖环境表面的25株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，显示对10种抗生素都有不同程度的耐药性，对苯唑西林红霉素、庆大霉素、克林霉素耐药率大于50%，对复方磺胺敏感。本研究中10株环境分离株对青霉素、氨苄西林、复方新诺明耐药性较高，对氟苯尼考、头孢唑啉、丁胺卡那敏感性较高，该结果可为养殖场的畜禽疾病防治提供指导，为进一步提高畜禽健康，保护人类安全。
畜禽养殖场周围环境源性微生物在很长时间被人们忽视，随着社会大众对环境安全认识的不断提高，环境源病原菌的危害越来越受到重视。本试验结果表明，养殖场周边环境中的金黄色葡萄球菌的耐药性以及致病性都很高，其对人和动物的潜在危害不可小觑。需要加强环境卫生管理并积极开展细菌耐药性监测，合理规范使用抗菌药物。
参考文献：
[1] DAHMS C，H？譈BNER N O，WILKE F，et al. Mini-review：Epidemiology and zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock and food[J].GMS Hyg Infect Control，2014（3）：21.
[2] 王江桥，罗 君，蔡 珠，等.金黄色葡萄球菌感染的特征及其耐药性[J].实用预防医学，2007，14（4）：990-992
[3] 贺建忠，陈宏伟，王贵强，等.金黄色葡萄球菌生物被膜形成与生物被膜相关基因的调查研究[J].江苏农业科学，2015，43（4）：55-59.
[4] CHEUNG A L，PROJAN S J，GRESHAM H. The genomic aspect of virulence，sepsis，and resistance to killing mechanisms in Staphylococcus ausaur[J].Curr Infect Dis ReP，2002（4）：400-410.
[5] RICHA J，MICHELLE C，JUDY M，et al .Specific roles of alpha-toxin and beta-toxin during Staphylococcus aureus cornea l infection[J].Infect Immun，1997，65（5）：1571-1578.
[6] 黄忠强，韦雪菱.生物膜阳性致病菌对常用消毒剂耐受性研究[J].中华医院感染学杂志，2011，21（16）：3420-3422.
[7] 孙燕萍.对畜禽生肉及养殖环境表面分离的金黄色葡萄球菌的药敏分析[J].中国药物经济学，2015（3）：178-179.
2.3 毒力因子的检测结果
在5%绵羊血平板上，20株金黄色葡萄球菌环境分离菌株生长良好，菌落较大，呈圆形、光滑凸起的金黄色菌落，有15株分离菌株的菌落周围生成完全溶血的透明圈（图1）。在脱脂奶粉平板上有18株菌株能形成溶蛋白圈（图2），说明这些菌株都能够产生溶血素和胞外蛋白酶。
2.4 生物膜检测结果
在没有外界因素诱导的条件下，20株环境分离菌株中共有17株在试管上能形成肉眼可见的生物膜， 有的在试管上形成很厚的生物膜，经结晶紫染色后试管液面部分和底部都留有结晶紫，生物膜形成能力弱的菌株仅在底部可以看到有结晶紫存在，而不能形成生物膜的菌株试管壁上几乎没有结晶紫存在（图3）。
3 讨论
随着畜禽养殖集约化的发展，抗生素作为禽畜疾病预防及药物治疗、促生长饲料添加剂等被广泛应用，而抗生素的滥用，导致耐药菌不断出现。畜禽养殖场废弃物如果不经过无害化处理直接排放到自然界，其中的抗生素将可能对土壤和水体造成严重的污染，表现为破坏土壤和水体中的菌群结构、打破微生态平衡并诱导耐药菌产生，威胁人类健康安全。近年来， 由畜禽粪便污染引起的人畜共患病传播与感染，已引起人们对畜禽粪便病原微生物污染的重视。
金黄色葡萄球菌在自然界广泛分布，是人畜皮肤、呼吸道、消化道黏膜上的常见菌群。当机体黏膜和皮肤破损或者抵抗力降低时，可通过损伤的皮肤、黏膜、呼吸道及消化道感染导致发病。金黄色葡萄球菌是畜禽养殖过程中最为常见的一種化脓性病原菌之一，能够引起畜禽多种疾病。以断奶后的仔猪易多发葡萄球菌病，主要表现为渗出性皮炎。牛常表现为坏疽性乳房炎和传染性乳房炎。禽在临床上表现症状很多，幼雏和中雏多呈败血症、浮肿性皮炎，成年鸡则多表现为关节炎、关节滑囊炎、腱鞘炎、脚球瘤等，还可见到化脓性骨髓炎、脓性眼炎、心内膜炎等。金黄色葡萄球菌的致病性跟其能否产生毒力因子有关，这些毒力因子能协助金黄色葡萄球菌侵袭组织细胞、逃避机体免疫系统的清除、产生耐药性等，其主要的毒力因子是胞外毒素和酶以及产生生物膜[4]。金黄色葡萄球菌侵入与产生的胞外蛋白酶有关，而进入机体后产生另外一些毒力因子进一步破坏宿主的组织器官，特别是α溶血素， 能够引起组织损伤，破坏宿主的免疫系统[5]，本研究发现，从养殖场粪便及周边环境中分离的菌株大部分能产生蛋白酶和溶血素，说明这些菌株具有一定的致病性。对分离菌株进行生物膜形成能力的测定发现，这些菌株在一定程度上能形成生物膜。生物膜一旦形成便可保护细菌不受传统抗菌药物的作用，导致长期的抗生素治疗无效。生物膜还可以保护细菌逃离体内的免疫反应，在恶劣的环境中持续存活下来[6]。
本研究通过对江苏和云南不同养殖场环境中金黄色葡萄球菌的调查，从养殖场的粪便以及周边的土壤和水体中都能够分离到金黄色葡萄球菌，通过对分离菌株进行药物敏感试验，结果显示，大部分环境分离菌株对10种养殖场常用药物都具有一定程度的耐药。孙燕萍[7]对来源于畜禽生肉和养殖环境表面的25株金黄色葡萄球菌进行药敏试验，显示对10种抗生素都有不同程度的耐药性，对苯唑西林红霉素、庆大霉素、克林霉素耐药率大于50%，对复方磺胺敏感。本研究中10株环境分离株对青霉素、氨苄西林、复方新诺明耐药性较高，对氟苯尼考、头孢唑啉、丁胺卡那敏感性较高，该结果可为养殖场的畜禽疾病防治提供指导，为进一步提高畜禽健康，保护人类安全。
畜禽养殖场周围环境源性微生物在很长时间被人们忽视，随着社会大众对环境安全认识的不断提高，环境源病原菌的危害越来越受到重视。本试验结果表明，养殖场周边环境中的金黄色葡萄球菌的耐药性以及致病性都很高，其对人和动物的潜在危害不可小觑。需要加强环境卫生管理并积极开展细菌耐药性监测，合理规范使用抗菌药物。
参考文献：
[1] DAHMS C，H？譈BNER N O，WILKE F，et al. Mini-review：Epidemiology and zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock and food[J].GMS Hyg Infect Control，2014（3）：21.
[2] 王江桥，罗 君，蔡 珠，等.金黄色葡萄球菌感染的特征及其耐药性[J].实用预防医学，2007，14（4）：990-992
[3] 贺建忠，陈宏伟，王贵强，等.金黄色葡萄球菌生物被膜形成与生物被膜相关基因的调查研究[J].江苏农业科学，2015，43（4）：55-59.
[4] CHEUNG A L，PROJAN S J，GRESHAM H. The genomic aspect of virulence，sepsis，and resistance to killing mechanisms in Staphylococcus ausaur[J].Curr Infect Dis ReP，2002（4）：400-410.
[5] RICHA J，MICHELLE C，JUDY M，et al .Specific roles of alpha-toxin and beta-toxin during Staphylococcus aureus cornea l infection[J].Infect Immun，1997，65（5）：1571-1578.
[6] 黄忠强，韦雪菱.生物膜阳性致病菌对常用消毒剂耐受性研究[J].中华医院感染学杂志，2011，21（16）：3420-3422.
[7] 孙燕萍.对畜禽生肉及养殖环境表面分离的金黄色葡萄球菌的药敏分析[J].中国药物经济学，2015（3）：178-179.
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