猪胞内劳森氏菌lscN基因的克隆及序列
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时间：2017-12-31
猪增生性肠炎（Porcine proliferative enteropathy，PPE）是由劳森氏菌（Lawsonia intracellularis，Li）感染引起的猪接触性肠道传染病[1]。该病主要发生在6～20周龄断奶猪，育成猪也可感染，引起顽固性腹泻，严重降低饲料转化率，导致养猪业受到经济损失[2]。三型分泌系统（Type Three Secretion System，TTSS）是一种跨细菌内外膜、细胞外空间和宿主细胞膜的蛋白运输装置，在革兰氏阴性菌中广泛存在，现已发现存在TTSS的致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等[3]。英国学者David G.E. Smith 在2009年运用染色体步移技术在Li分离株中鉴定到编码TTSS的基因区域，其中lscN是为效应蛋白跨膜提供能量的ATP酶[4]，因此，本试验对lscN进行克隆及序列分析，为后续LscN蛋白的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple载体、DH5α感受态细胞、GoldenView、琼脂糖购自宝生物工程（大连）有限公司；Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培养基由龙岩学院生命科学学院动物医学系提供。
1.1.2 引物 从GenBank中下载lscN（LI_RS02940）的序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海华津生物科技有限公司合成，引物序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 采用巢式PCR扩增目的片段。第一重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物1、2各1 μL （10 pmol/L），模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。第二重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物3、4各1 μL （10 pmol/L），第一重PCR产物1 μL（100倍稀释），加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。同时设立空白对照。取第二重PCR产物5 μL加入上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用凝胶成像仪观察并记录结果。
1.2.2 PCR产物回收 将余下的20 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中称重。向胶块中加入3倍体积Buffer G，50 ℃水浴10 min，其间温和地上下颠倒数次。然后加入1倍体积异丙醇，上下颠倒混匀。向已装入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S，12 000 r/min离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将前面得到的溶液加入到吸附柱中，室温放置2 min，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，空离2 min。将吸附柱放入1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入10 μL Buffer B，室温静置1～2 min，12 000 r/min离心1 min，回收得到目的片段。
1.2.3 PCR产物克隆T载体 取回收目的片段7 μL，pMD18-T载体0.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，T4 DNA ligase buffer 1 μL，4 ℃连接过夜。将连接产物5 μL，DH5α 50 μL加入1.5 mL离心管，冰浴30 min，然后42 ℃水浴90 s，接着再冰浴2 min，加入1 mL SOC，摇床振荡培养45 min，吸取200 μL培养液涂布100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，然后挑菌，PCR鉴定。
1.2.4 基因测序与序列分析 将阳性克隆扩大培养，送上海华津生物科技有限公司测序。对测序获得的序列进行同源性比较分析。
2 结果与分析
2.1 目的片段扩增结果
采用巢式PCR扩增目的片段。第一重PCR扩增得到1 517 bp产物，第二重PCR扩增得到1 317 bp产物（图1），结果与预期相符。
2.2 目的片段克隆T载体结果
目的片段连接T载体后，转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，细菌生长情况见图2。
挑取8個单菌落转接100 μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基，PCR鉴定结果见图3。1～3、5～8号菌均为阳性克隆。
2.3 目的片段测序结果与序列分析
采用NCBI网站中的BLAST工具，将lscN与GenBank中的序列进行比较，结果lscN与GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%（图4）。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 PCR LA Mix、PCR Taq Mix、2 000 bp Marker、T4 DNA ligase、pMD18-T simple载体、DH5α感受态细胞、GoldenView、琼脂糖购自宝生物工程（大连）有限公司；Tris、EDTA-Na2、NaCl、LB培养基由龙岩学院生命科学学院动物医学系提供。
1.1.2 引物 从GenBank中下载lscN（LI_RS02940）的序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海华津生物科技有限公司合成，引物序列见表1。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增 采用巢式PCR扩增目的片段。第一重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物1、2各1 μL （10 pmol/L），模板DNA 1 μL，加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。第二重PCR反应体系为：2×PCR LA Mix 12.5 μL，引物3、4各1 μL （10 pmol/L），第一重PCR产物1 μL（100倍稀释），加灭菌超纯水至25 μL；PCR 反应条件为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。同时设立空白对照。取第二重PCR产物5 μL加入上样缓冲液后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，用凝胶成像仪观察并记录结果。
1.2.2 PCR产物回收 将余下的20 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干净的离心管中称重。向胶块中加入3倍体积Buffer G，50 ℃水浴10 min，其间温和地上下颠倒数次。然后加入1倍体积异丙醇，上下颠倒混匀。向已装入收集管中的吸附柱中加入200 μL Buffer S，12 000 r/min离心2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将前面得到的溶液加入到吸附柱中，室温放置2 min，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。吸附柱中加入500 μL Buffer G，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入650 μL Buffer W，12 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，空离2 min。将吸附柱放入1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入10 μL Buffer B，室温静置1～2 min，12 000 r/min离心1 min，回收得到目的片段。
1.2.3 PCR产物克隆T载体 取回收目的片段7 μL，pMD18-T载体0.5 μL，T4 DNA ligase 1.5 μL，T4 DNA ligase buffer 1 μL，4 ℃连接过夜。将连接产物5 μL，DH5α 50 μL加入1.5 mL离心管，冰浴30 min，然后42 ℃水浴90 s，接着再冰浴2 min，加入1 mL SOC，摇床振荡培养45 min，吸取200 μL培养液涂布100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜，然后挑菌，PCR鉴定。
1.2.4 基因测序与序列分析 将阳性克隆扩大培养，送上海华津生物科技有限公司测序。对测序获得的序列进行同源性比较分析。
2 结果与分析
2.1 目的片段扩增结果
采用巢式PCR扩增目的片段。第一重PCR扩增得到1 517 bp产物，第二重PCR扩增得到1 317 bp产物（图1），结果与预期相符。
2.2 目的片段克隆T载体结果
目的片段连接T载体后，转化DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，细菌生长情况见图2。
挑取8個单菌落转接100 μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基，PCR鉴定结果见图3。1～3、5～8号菌均为阳性克隆。
2.3 目的片段测序结果与序列分析
采用NCBI网站中的BLAST工具，将lscN与GenBank中的序列进行比较，结果lscN与GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%（图4）。
3 小結与讨论
增生性肠炎以回肠炎和结肠隐窝未成熟细胞腺瘤样增生为特征，引起饲料转化率低下，猪只生长迟缓，很大程度上影响生猪产业经济效益。劳森氏菌是增生性肠炎的致病菌，该菌专性细胞内生长，微需氧，生长要求苛刻。因此，许多分子生物学技术难于应用其上，相关研究十分有限，目前研究主要集中于运用各种测序技术寻找在劳森氏菌致病性中发挥作用的基因或蛋白。英国学者David G.E. Smith 在2009年运用染色体步移技术在其分离株LR189/5/83中鉴定到编码三型分泌系统的基因区域，发现与耶尔森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ，然而却未见后续报道。
TTSS与许多革兰氏阴性菌毒力因子分泌有关，现已发现存在TTSS的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等。大肠杆菌通过TTSS改变宿主离子通道，传递效应蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主细胞中发挥毒力作用；沙门氏菌和志贺氏菌通过TTSS入侵宿主，影响宿主膜泡运输[5]。耶尔森氏菌YscN蛋白为ATPase，在识别底物和启动酶反应中起作用，为伴侣蛋白绑定效应蛋白提供能量[6]。YscO在大肠杆菌上的同源物EscO有稳定EscN结构，刺激ATPase活化的作用[7]，YscO并不发挥这样的作用，而是识别与其绑定配体的保守基团[8]。YscQ是TTSS注射小体内环组件，由yscQ翻译的两个蛋白组成，可容纳YscN。因此推测Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用，故本试验对lscN克隆测序，为后续蛋白的研究奠定基础。
目前，欧美报道的猪劳森氏菌分离株有PHE/MN1-00（美国）、NWumn05（美国）、VPB4（美国）、GB106（美国）、DBumn06（美国）、D15540（丹麦）、PHE-BR（巴西）、963/3（英国）、916/91（英国）、LR189/5/83（英国）等。GenBank中报道全基因组序列的仅有PHE/MN1-00和N343两株。采用NCBI网站中的BLAST工具，将扩增到的lscN与GenBank中的序列进行比较，结果lscN与GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%，说明该基因保守性较高。
参考文献：
[1] 俞道进.猪增生性肠炎研究进展[J].动物医学进展，2001，22（3）：24-27.
[2] 梁正维.增生性肠炎的严重威胁[J].国外畜牧学：猪与禽，2000（5）：54-55.
[3] DIEPOLD A，WAGNER S. Assembly of the bacterial type III secretion machinery[J].FEMS Microbiology Reviews，2014，38（4）：802-822.
[4] ALBERDI M P，WATSON E，MCALLISTER G E M，et al. Expression by Lawsonia intracellularis of type III secretion system components during infection[J].Veterinary Microbiology，2009，139（3）：298-303.
[5] HODGES K，HECHT G.Interspecies communication in the gut， from bacterial delivery to host-cell response[J].The Journal of Physiology，2012，590（3）：433-440.
[6] BLAYLOCK B，RIORDAN K E，MISSIAKAS D M，et al. Characterization of the Yersinia enterocolitica type III secretion ATPase YscN and its regulator，YscL[J].Journal of Bacteriology，2006，188（10）：3525-3534.
[7] ROMO-CASTILLO M，ANDRADE A，ESPINOSA N，et al. EscO，a functional and structural analog of the flagellar FliJ protein，is a positive regulator of EscN ATPase activity of the enteropathogenic Escherichia coli injectisome[J].Journal of Bacteriology，2014，196（12）： 2227-2241.
[8] MUKERJEA R，GHOSH P.Functionally essential interaction between Yersinia YscO and the T3S4 domain of YscP[J].Journal of bacteriology，2013，195（20）：4631-4638.
增生性肠炎以回肠炎和结肠隐窝未成熟细胞腺瘤样增生为特征，引起饲料转化率低下，猪只生长迟缓，很大程度上影响生猪产业经济效益。劳森氏菌是增生性肠炎的致病菌，该菌专性细胞内生长，微需氧，生长要求苛刻。因此，许多分子生物学技术难于应用其上，相关研究十分有限，目前研究主要集中于运用各种测序技术寻找在劳森氏菌致病性中发挥作用的基因或蛋白。英国学者David G.E. Smith 在2009年运用染色体步移技术在其分离株LR189/5/83中鉴定到编码三型分泌系统的基因区域，发现与耶尔森氏菌yscN、yscO、yscQ高度同源的基因lscN、lscO、lscQ，然而却未见后续报道。
TTSS与许多革兰氏阴性菌毒力因子分泌有关，现已发现存在TTSS的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等。大肠杆菌通过TTSS改变宿主离子通道，传递效应蛋白Tir、EspF、Map、EspG1、EspG2到宿主细胞中发挥毒力作用；沙门氏菌和志贺氏菌通过TTSS入侵宿主，影响宿主膜泡运输[5]。耶尔森氏菌YscN蛋白为ATPase，在识别底物和启动酶反应中起作用，为伴侣蛋白绑定效应蛋白提供能量[6]。YscO在大肠杆菌上的同源物EscO有稳定EscN结构，刺激ATPase活化的作用[7]，YscO并不发挥这样的作用，而是识别与其绑定配体的保守基团[8]。YscQ是TTSS注射小体内环组件，由yscQ翻译的两个蛋白组成，可容纳YscN。因此推测Li的LscN、LscO、LscQ有相似作用，故本试验对lscN克隆测序，为后续蛋白的研究奠定基础。
目前，欧美报道的猪劳森氏菌分离株有PHE/MN1-00（美国）、NWumn05（美国）、VPB4（美国）、GB106（美国）、DBumn06（美国）、D15540（丹麦）、PHE-BR（巴西）、963/3（英国）、916/91（英国）、LR189/5/83（英国）等。GenBank中报道全基因组序列的仅有PHE/MN1-00和N343两株。采用NCBI网站中的BLAST工具，将扩增到的lscN与GenBank中的序列进行比较，结果lscN与GenBank中PHE/MN1-00、N343同源性为99%，说明该基因保守性较高。
参考文献：
[1] 俞道进.猪增生性肠炎研究进展[J].动物医学进展，2001，22（3）：24-27.
[2] 梁正维.增生性肠炎的严重威胁[J].国外畜牧学：猪与禽，2000（5）：54-55.
[3] DIEPOLD A，WAGNER S. Assembly of the bacterial type III secretion machinery[J].FEMS Microbiology Reviews，2014，38（4）：802-822.
[4] ALBERDI M P，WATSON E，MCALLISTER G E M，et al. Expression by Lawsonia intracellularis of type III secretion system components during infection[J].Veterinary Microbiology，2009，139（3）：298-303.
[5] HODGES K，HECHT G.Interspecies communication in the gut， from bacterial delivery to host-cell response[J].The Journal of Physiology，2012，590（3）：433-440.
[6] BLAYLOCK B，RIORDAN K E，MISSIAKAS D M，et al. Characterization of the Yersinia enterocolitica type III secretion ATPase YscN and its regulator，YscL[J].Journal of Bacteriology，2006，188（10）：3525-3534.
[7] ROMO-CASTILLO M，ANDRADE A，ESPINOSA N，et al. EscO，a functional and structural analog of the flagellar FliJ protein，is a positive regulator of EscN ATPase activity of the enteropathogenic Escherichia coli injectisome[J].Journal of Bacteriology，2014，196（12）： 2227-2241.
[8] MUKERJEA R，GHOSH P.Functionally essential interaction between Yersinia YscO and the T3S4 domain of YscP[J].Journal of bacteriology，2013，195（20）：4631-4638.
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