荧光PCR技术在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应
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时间：2017-09-02
1 资料与方法
1.1 一般资料
该次研究选取2015年1月—2016年12月青州市从业人员5 900例的肛拭子粪便标本作为研究对象，男3 500例，女2 400例，年龄26～52岁，平均年龄为（43.2±3.2）岁。
1.2 研究方法
对5900例从业人员的肛拭子粪便样本分别实施传统国标方法和荧光PCR技术进行筛查。具体如下：①传统国标方法：参照《食品卫生微生物学沙门氏菌检验》（GB-T4789.4-2003）和《食品卫生微生物学志贺氏菌检验》（GB-T4789.5-2003）进行检测。②PCR技术筛查：参照WS/T454 -2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案用实时荧光 PCR 试剂盒进行实时荧光PCR检测。将其中检出的阳性样本进行血清鉴定和生化鉴定。
1.3 统计方法
应用SPSS 13.0统计学软件对研究数据进行分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，检验水平α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组筛查方式的阳性率比较
培养确诊的沙门氏菌5例，阳性率为0.85%，志贺氏菌5例，阳性率为0.85%；荧光PCR技术检出的沙门氏菌7例，阳性率为1.19%，志贺氏菌6例，阳性率为10.17%；传统国标方法检出的沙门氏菌2例，阳性率为0.34%，志贺氏菌3例，阳性率为0.51%。荧光PCR技术检查的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；传统国标方法检出的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 荧光PCR技术检查对沙门氏菌检测结果的准确率
灵敏度=A/（A+B）×100%=10/（10+0）×100%=100%；特异性=D/（C+D）×100%=11 787/（3+11 787）×100%=99.97%。荧光PCR沙门氏菌检测阳性5（A）、2（C），阴性0（B）、5 893（D）；培养确诊沙门氏菌检测阳性5（A）、0（B）；阴性2（C）、5 893（D）。荧光PCR技术检查对沙门氏菌检测结果的灵敏度显著高于传统国标方法，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 荧光PCR技术检查对志贺氏菌检测结果的准确率
灵敏度=A/（A+B）×100%=9/（9+0）×100%=100%；特异性=D/（C+D）×100%=11 789/（2+11 789）×100%=99.98%。荧光PCR志贺氏菌检测阳性4（A）、2（C），阴性0（B）、5 896（D）；培养确诊志贺氏菌检测阳性4（A）、0（B）；阴性2（C）、5 896（D）。荧光PCR技术检查对志贺氏菌检测结果的灵敏度显著高于传统国标方法，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 討论
1.1 一般资料
该次研究选取2015年1月—2016年12月青州市从业人员5 900例的肛拭子粪便标本作为研究对象，男3 500例，女2 400例，年龄26～52岁，平均年龄为（43.2±3.2）岁。
1.2 研究方法
对5900例从业人员的肛拭子粪便样本分别实施传统国标方法和荧光PCR技术进行筛查。具体如下：①传统国标方法：参照《食品卫生微生物学沙门氏菌检验》（GB-T4789.4-2003）和《食品卫生微生物学志贺氏菌检验》（GB-T4789.5-2003）进行检测。②PCR技术筛查：参照WS/T454 -2014《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案用实时荧光 PCR 试剂盒进行实时荧光PCR检测。将其中检出的阳性样本进行血清鉴定和生化鉴定。
1.3 统计方法
应用SPSS 13.0统计学软件对研究数据进行分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，检验水平α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组筛查方式的阳性率比较
培养确诊的沙门氏菌5例，阳性率为0.85%，志贺氏菌5例，阳性率为0.85%；荧光PCR技术检出的沙门氏菌7例，阳性率为1.19%，志贺氏菌6例，阳性率为10.17%；传统国标方法检出的沙门氏菌2例，阳性率为0.34%，志贺氏菌3例，阳性率为0.51%。荧光PCR技术检查的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；传统国标方法检出的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 荧光PCR技术检查对沙门氏菌检测结果的准确率
灵敏度=A/（A+B）×100%=10/（10+0）×100%=100%；特异性=D/（C+D）×100%=11 787/（3+11 787）×100%=99.97%。荧光PCR沙门氏菌检测阳性5（A）、2（C），阴性0（B）、5 893（D）；培养确诊沙门氏菌检测阳性5（A）、0（B）；阴性2（C）、5 893（D）。荧光PCR技术检查对沙门氏菌检测结果的灵敏度显著高于传统国标方法，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 荧光PCR技术检查对志贺氏菌检测结果的准确率
灵敏度=A/（A+B）×100%=9/（9+0）×100%=100%；特异性=D/（C+D）×100%=11 789/（2+11 789）×100%=99.98%。荧光PCR志贺氏菌检测阳性4（A）、2（C），阴性0（B）、5 896（D）；培养确诊志贺氏菌检测阳性4（A）、0（B）；阴性2（C）、5 896（D）。荧光PCR技术检查对志贺氏菌检测结果的灵敏度显著高于传统国标方法，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 討论
按照我國颁布实施的《中华人民共和国食品卫生安全法》《公共场所卫生管理条例》中的相关要求来看，对于患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎（消化道传播）、活动性肺结核，化脓性或者渗出性皮肤病以及其他有妨碍公共卫生等疾病的患者，在没有得到良好治愈的情况下，不得从事直接为顾客服务的工作。这一规定是从疾病防治的角度出发来考虑的，其实施的主要目的是为了更好地维护公共健康，降低以上各类疾病的传播。
在以上几种危害公共健康的疾病之中，伤寒痢疾是一种危害性较大的疾病，具有较强的传染性，伤寒痢疾无临床症状，因此不易被人们重视，并加以管理，常常由于排菌污染食品而导致伤寒痢疾的传播和流行，对公众的健康造成了极大的危害。因此，伤寒痢疾成为了危害公共健康的一个重要因素。鉴于此，对从业人员伤寒痢疾的快速筛查，对于维护公共健康具有重要的意义。而要想实现对从业人员伤寒痢疾的快速筛查，就需要一种高效、快速、高灵敏度的筛查方法，这对于确保从业人员伤寒痢疾的筛查效果十分重要。
一直以来沿用的传统的从业人员伤寒痢疾快速筛查，主要采取的是国标方法，这种筛查方法是参照《食品卫生微生物学沙门氏菌检验》（GB-T4789.4-2003）和《食品卫生微生物学志贺氏菌检验》（GB-T4789.5-2003）中的相关规定和要求制定检测方案进行检测的。传统的国标方法一直以来在从业人员伤寒痢疾筛查中具有一定的效果，因此，长久以来从业人员伤寒痢疾的筛查一直沿用这种检测方法。但是在长久的实践应用中，传统国标方法在从业人员伤寒痢疾筛查中的缺点和不足也逐渐凸显，首先这种检测方法用时较久，一般来说一次检测往往需要5～7 d的时间才能够获得检测结果，因此，这种检测方法无法实现快速筛查。其次传统国标方法在从业人员伤寒痢疾的检测中还存在灵敏度较低的问题。因此，传统国标方法在从业人员伤寒痢疾筛查中的应用，并不理想。在这样的情况之下，临床急需一种快速、高效、灵敏度较高的从业人员伤寒痢疾快速筛查方式，来提高从业人员伤寒痢疾快速筛查的筛查速度、筛查效率和筛查没灵敏度。
荧光PCR技术的引入和应用为从业人员伤寒痢疾的快速筛查提供了一条全新的途径[2]。荧光PCR技术是WS/T454-2014 《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案以经典培养法为依据，利用实时荧光 PCR 法灵敏、快速的优点和经典培养方法准确可靠的优点相结合，从而探讨建立高效、准确、省力的一种全新的从业人员伤寒痢疾筛查方案。这一检测方案在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用，表现出了极大的应用优势。从该次研究结果来看，该次研究通过对5 900例从业人员的肛拭子粪便样本实施筛查，最终检出了沙门菌5例，阳性率为0.85%和志贺菌5例，阳性率为0.85%。而荧光PCR技术检出的沙门氏菌7例，阳性率为1.19%，志贺氏菌6例，阳性率为10.17%；传统国标方法检出的沙门氏菌2例，阳性率为0.34%，志贺氏菌3例，阳性率为0.51%。荧光PCR技术检查的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；传统国标方法检出的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。这一结果提示出，荧光PCR检测方法对沙门氏菌和志贺氏菌的检测准确率更高，与培养确诊结果更加符合，在从业人员伤寒痢疾的快速筛查中具有更高的应用价值。且该次研究结果还表明，荧光PCR检测在从业人员伤寒痢疾的快速筛查中，较传统国标方法具有更高的灵敏度和特异性。由此可见，荧光PCR筛查法在从业人员伤寒痢疾筛查中具有更加显著的应用效果，不仅如此，荧光PCR筛查法的引入和应用，还给从业人员的伤寒痢疾筛查工作带来了改革与进步。具体表现在以下几个方面：其一是表现在采样环节的改革与进步，荧光PCR筛查过程中，所配套使用的生科源“多功能采样器”，为一体化的专业设计，该设计集合了采样环节所涉及的采样、运输、增菌、取样多功能需求。多功能采样器配备了灭菌增菌液，这样的设计省去了传统方法筛查过程中的采样瓶清洗、配液、消毒等环节，可直接进行使用。这样的设计一方面节省了传统筛查方法中进行采样时，需进行人工准备过程中所消耗的大量人力，另一方面这样的设计也很好地消除了该环节潜在的污染风险。不仅如此，多功能采样器在制造过程中使用的是全塑料组件，全塑料组件具有不破碎、不漏液的优点，这样能够很好的避免标本在运输过程意外产生的样本交叉污染问题。同时，在取样时无需开启采样器瓶盖，这样能够很好地避免标本取样的操作失误和标本污染[3]。其二是表现在检测环节的改革与进步，主要表现在筛查结果仪器自动判读，可积极有效的规避、消除主观因素造成的实验误差；显著的缩短了检验时间，真正实现了从业人员伤寒痢疾的快速筛查；且荧光PCR筛查能够实现一人操作，从而显著的减少了工作人员的工作量，提高了检验工作效率；检验结果所得的数据采取电脑管理，因此，检验结果数据能够实现原始数据追溯[4]。本次研究中，所用的荧光PCR筛查技术，其中的PCR 试剂应用的是改良分子信标设计。由于改良分子信标更短，因此其与靶序列结合更紧密，使得扩增条件要求不严。因此，应用改良分子信标设计的荧光PCR筛查方法更加适合在基层进行大范围的应用，为实现基层推广应用提供了条件。综合来看，该技术方案为整体技术方法，提供了从采样到PCR筛查所需要配套的多功能采样器、PCR试剂盒以及各技术环节的配套细节设计。新技术方案是刚颁布的国家卫生标准，填补了这一领域的技术空白，是一个实用、简便、有效的技术规范[5]。鉴于此，荧光PCR筛查法不仅具有快速、高效，高灵敏度、高特异度的从业人员伤寒痢疾筛查效果，同时该筛查方法也更加适合在基层进行推广应用。
综上所述，PCR筛查法检测技术对健康体检人员的肠道致病菌进行快速筛查可以使检验的时间得以缩短，而且特异度强、灵敏度高，兼具时效性与客观性，更适合基层实验室规范统一地开展健康带菌检测工作。
[参考文献]
[1] 韩毅，孙燕萍，周虹.实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究[J].中国食品卫生杂志，2015，27（2）：132.
[2] 杨小鹃，吴清平，张菊梅，等.畜禽肉沙门氏菌和大肠杆菌 0157多重PCR检测研究[J].微生物学通报，2008，35（3）：470-474.
[3] 刘红，杨帆，张笑冰，等.痢疾杆菌全基因组序列及基因组岛的分析[J].中国工程科学，2002，4（10）：40.
[4] 尹荣焕，尹荣兰，杨玉英，等.PCR技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究[J].安徽农业科学，2006，134（2）：222，226.
[5] 刘华伟，郭蔼光，马立农，等.PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用[J].动物医学进展，2004，25（6）：55-58.
在以上几种危害公共健康的疾病之中，伤寒痢疾是一种危害性较大的疾病，具有较强的传染性，伤寒痢疾无临床症状，因此不易被人们重视，并加以管理，常常由于排菌污染食品而导致伤寒痢疾的传播和流行，对公众的健康造成了极大的危害。因此，伤寒痢疾成为了危害公共健康的一个重要因素。鉴于此，对从业人员伤寒痢疾的快速筛查，对于维护公共健康具有重要的意义。而要想实现对从业人员伤寒痢疾的快速筛查，就需要一种高效、快速、高灵敏度的筛查方法，这对于确保从业人员伤寒痢疾的筛查效果十分重要。
一直以来沿用的传统的从业人员伤寒痢疾快速筛查，主要采取的是国标方法，这种筛查方法是参照《食品卫生微生物学沙门氏菌检验》（GB-T4789.4-2003）和《食品卫生微生物学志贺氏菌检验》（GB-T4789.5-2003）中的相关规定和要求制定检测方案进行检测的。传统的国标方法一直以来在从业人员伤寒痢疾筛查中具有一定的效果，因此，长久以来从业人员伤寒痢疾的筛查一直沿用这种检测方法。但是在长久的实践应用中，传统国标方法在从业人员伤寒痢疾筛查中的缺点和不足也逐渐凸显，首先这种检测方法用时较久，一般来说一次检测往往需要5～7 d的时间才能够获得检测结果，因此，这种检测方法无法实现快速筛查。其次传统国标方法在从业人员伤寒痢疾的检测中还存在灵敏度较低的问题。因此，传统国标方法在从业人员伤寒痢疾筛查中的应用，并不理想。在这样的情况之下，临床急需一种快速、高效、灵敏度较高的从业人员伤寒痢疾快速筛查方式，来提高从业人员伤寒痢疾快速筛查的筛查速度、筛查效率和筛查没灵敏度。
荧光PCR技术的引入和应用为从业人员伤寒痢疾的快速筛查提供了一条全新的途径[2]。荧光PCR技术是WS/T454-2014 《从业人员预防性健康检查沙门菌志贺菌检验方法》技术方案以经典培养法为依据，利用实时荧光 PCR 法灵敏、快速的优点和经典培养方法准确可靠的优点相结合，从而探讨建立高效、准确、省力的一种全新的从业人员伤寒痢疾筛查方案。这一检测方案在从业人员伤寒痢疾快速筛查中的应用，表现出了极大的应用优势。从该次研究结果来看，该次研究通过对5 900例从业人员的肛拭子粪便样本实施筛查，最终检出了沙门菌5例，阳性率为0.85%和志贺菌5例，阳性率为0.85%。而荧光PCR技术检出的沙门氏菌7例，阳性率为1.19%，志贺氏菌6例，阳性率为10.17%；传统国标方法检出的沙门氏菌2例，阳性率为0.34%，志贺氏菌3例，阳性率为0.51%。荧光PCR技术检查的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异无统计学意义（P>0.05）；传统国标方法检出的沙门氏菌阳性率和志贺氏菌阳性率与培养确诊的阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。这一结果提示出，荧光PCR检测方法对沙门氏菌和志贺氏菌的检测准确率更高，与培养确诊结果更加符合，在从业人员伤寒痢疾的快速筛查中具有更高的应用价值。且该次研究结果还表明，荧光PCR检测在从业人员伤寒痢疾的快速筛查中，较传统国标方法具有更高的灵敏度和特异性。由此可见，荧光PCR筛查法在从业人员伤寒痢疾筛查中具有更加显著的应用效果，不仅如此，荧光PCR筛查法的引入和应用，还给从业人员的伤寒痢疾筛查工作带来了改革与进步。具体表现在以下几个方面：其一是表现在采样环节的改革与进步，荧光PCR筛查过程中，所配套使用的生科源“多功能采样器”，为一体化的专业设计，该设计集合了采样环节所涉及的采样、运输、增菌、取样多功能需求。多功能采样器配备了灭菌增菌液，这样的设计省去了传统方法筛查过程中的采样瓶清洗、配液、消毒等环节，可直接进行使用。这样的设计一方面节省了传统筛查方法中进行采样时，需进行人工准备过程中所消耗的大量人力，另一方面这样的设计也很好地消除了该环节潜在的污染风险。不仅如此，多功能采样器在制造过程中使用的是全塑料组件，全塑料组件具有不破碎、不漏液的优点，这样能够很好的避免标本在运输过程意外产生的样本交叉污染问题。同时，在取样时无需开启采样器瓶盖，这样能够很好地避免标本取样的操作失误和标本污染[3]。其二是表现在检测环节的改革与进步，主要表现在筛查结果仪器自动判读，可积极有效的规避、消除主观因素造成的实验误差；显著的缩短了检验时间，真正实现了从业人员伤寒痢疾的快速筛查；且荧光PCR筛查能够实现一人操作，从而显著的减少了工作人员的工作量，提高了检验工作效率；检验结果所得的数据采取电脑管理，因此，检验结果数据能够实现原始数据追溯[4]。本次研究中，所用的荧光PCR筛查技术，其中的PCR 试剂应用的是改良分子信标设计。由于改良分子信标更短，因此其与靶序列结合更紧密，使得扩增条件要求不严。因此，应用改良分子信标设计的荧光PCR筛查方法更加适合在基层进行大范围的应用，为实现基层推广应用提供了条件。综合来看，该技术方案为整体技术方法，提供了从采样到PCR筛查所需要配套的多功能采样器、PCR试剂盒以及各技术环节的配套细节设计。新技术方案是刚颁布的国家卫生标准，填补了这一领域的技术空白，是一个实用、简便、有效的技术规范[5]。鉴于此，荧光PCR筛查法不仅具有快速、高效，高灵敏度、高特异度的从业人员伤寒痢疾筛查效果，同时该筛查方法也更加适合在基层进行推广应用。
综上所述，PCR筛查法检测技术对健康体检人员的肠道致病菌进行快速筛查可以使检验的时间得以缩短，而且特异度强、灵敏度高，兼具时效性与客观性，更适合基层实验室规范统一地开展健康带菌检测工作。
[参考文献]
[1] 韩毅，孙燕萍，周虹.实时荧光定量PCR法与分离培养法检测食品从业人员沙门菌和志贺菌的比较研究[J].中国食品卫生杂志，2015，27（2）：132.
[2] 杨小鹃，吴清平，张菊梅，等.畜禽肉沙门氏菌和大肠杆菌 0157多重PCR检测研究[J].微生物学通报，2008，35（3）：470-474.
[3] 刘红，杨帆，张笑冰，等.痢疾杆菌全基因组序列及基因组岛的分析[J].中国工程科学，2002，4（10）：40.
[4] 尹荣焕，尹荣兰，杨玉英，等.PCR技术检测熟肉制品中沙门氏菌的研究[J].安徽农业科学，2006，134（2）：222，226.
[5] 刘华伟，郭蔼光，马立农，等.PCR技术在沙门氏菌快速检测中的应用[J].动物医学进展，2004，25（6）：55-58.
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